种感兴趣模式例如在ΔΔ中表达增加或抑制的基因小鼠与对照组相比表示为一系列和对于每个基因计算其表达值和每个预定义模式的皮尔逊相关系数确定与每个基因的表达最相关的模式根据分配给基因的模式对基因进行手动排序。使用和软件程序将表达值可视化为彩色图。对于彩色图显示表达强度值的对数首先以四个实验组中的值的质心平均值为中心。定量。

使用基于的系统进行定量以量化基因表达阵列

中发现差异表达的选定基因的表达。为此将μ转化为然后使用设计的引物进行。引物序列如下。根据制造商的说明使用扩增每个样品μ。进行扩增℃秒℃秒个循环。之后进行两个额外的循环以生成解离曲线该曲线用于验证生成的信号是荷兰企业电子邮件列表否来自单个目标扩增子或其他非特异性模板例如引物二聚体或污染的基因组。对连续稀释的样品进行扩增以测量效率并绘制每个样品的标准曲线用于计算目标信息的相对浓度。使用快速实时系统检测产物及其解离曲线。每个样品中的水平用作内部对照。这些值是相对于内部对照的水平来表达的并

通过执行在小鼠基因型之间进行比较测果肺部

缺陷的条件性小鼠模型。通过将小鼠与小鼠在基因控制下表达杂交使支气管上皮中的基因失活。小鼠的等位基因包含围绕由外显子编码的磷酸酶结构域的位点。根据报告小鼠中的表达该敲入等位基因的表达具有支气管特异性。李等人已提交手稿。ΔΔ小鼠的分析表明条克罗地亚电话号码列表件性等位基因的重组是肺特异性的没有渗漏到其他组织图。细胞表达如对照ΔΔ小鼠中和的共定位所示图。基于和在ΔΔ小鼠中不共定位的事实诱导重组后在细胞中检测不到图。图。图小鼠肺组织中条件等位基因的特异性重组。从指定组织中提取并使用引物进行检测种系或重组Δ状态的条件等位基因。

出适当分子量的条带。查看大图下载幻灯片小鼠肺组织中条件等位基因的特异性重组。从指定组织中提取并使用引物进行检测种系或重组Δ状态的条件等位基因。产物进行凝胶电泳并拍照显示出适当分子量的条带。图图细胞中的特异性失活。使用针对绿色或红色的抗体对具有所示基因型的小鼠的肺组织样本进行免疫荧光染色并将其合并。信号在未经历失活的小鼠的支气管上皮中重叠但在经历过失活ΔΔ的小鼠中不重叠。代表性支气管以纵切面和横截面显示。

&染色显示了支气管组织学查看大

图下载幻灯片细胞中的特异性失活。使用针对绿色或红色的抗体对具有指定基因型的小鼠的肺组织样本进行免疫荧光染色并将其合并。信号在未经历失活的小鼠的支气管上皮中重叠但在经历过失活ΔΔ的小鼠中不重叠。代表性支气管以纵切爱沙尼亚企业电子邮件列表面和横截面显示。&染色显示了支气管组织学。ΔΔ小鼠具有存活能力没有表现出外在表型异常并且在整个研究过程中长达个月保持健康。尸检时它们的肺重量与对照小鼠相似并且支气管上皮组织学正常数据未显示。

我们的结论是驱动的缺乏不足以引发肺部肿瘤发生

驱动的致癌表达诱导肺部病变。为了激活克拉拉细胞中致癌的表达小鼠与小鼠杂交其中致癌的表达塞浦路斯电话号码列表由可移除的转录终止元件控制。从小鼠获得的肺组织显示等位基因的重组补充图泳道。中的中位生存期小鼠为周。为了检查肺部组织学变化小鼠在至周龄时被处死并使用标准化标准来表征肺部病变。在周龄时首次通过显微镜检测到病变包括肺泡和细支气管的多灶性病变包括非典型病变和腺瘤实性或乳头状图。

缓或逆转了其生长图虚线因此到研究结束时用媒介物治疗的小鼠与用治疗的小鼠的肿瘤负荷明显不同图和补充图。胞外结构域突变形成配体敏感的分子间二硫键和激酶激活的常见机制是通过形成共价结合的受体二聚体。尽管受体酪氨酸激酶通过分子内二硫键维持配体结合和受体二聚化所需的细胞外结构但突变受体可以通过突变本身产生的新半胱氨酸残基或通过结构分子内二硫键附近的突变残基产生的不稳定性形成分子间二硫键二聚体。这种机制之前是针对我们在肺和中观察到的突变建立的。

为了评估和的突变是否导致共价二聚化以及

二聚化是否可以通过配体刺激增加我们将细胞在或和μ肝素存在下进行血清饥饿小时或在和μ肝素存在下分钟然后用洗涤并在存在下进行血清饥饿处理剩余的时间。小时然后在还原和非还原条件下进行电泳。在没有配体的情况下突变足以驱动共价德国企业电子邮件列表二聚化但即使在分钟的配体刺激下二聚化也会增加补充图。另一方面在突变中观察到二聚化但在配体刺激条件下并未增加补充图。如之前所示蛋白通常形成高度糖基化的折叠蛋白产物。尽管似乎存在糖基化缺陷导致其分子量较低但这

种突变形式仍然保留二聚化的能力然后

我们将相同的细胞接种到含有单独的μ肝素或和μ肝素的软琼脂中。周后我们观察到和肝素处理后的集落形成量比单独肝哥斯达黎加电话号码列表素或处理的细胞要多补充图。和驱动的细胞转化被临床相关的抑制剂阻断在确定肺中的和突变驱动细胞中的锚定非依赖性生长后我们询问小分子抑制剂是否可以阻断这种转化。将细胞在存在或不存在多激酶抑制剂帕纳替尼的情况下接种到软琼脂中该抑制剂针对伊马替尼耐药的并且具有针对家族成员的活性。

中在存在的情况下集落形成受到抑制但在含有激活插入的细胞中则不然图左边。中的所有突变和中的在暴露于药物时均丧失集落形成潜力而激酶结构域突变在药物下丧失集落形成潜力。例外的是以亚型表达其表现与突变相似而的抑制浓度比任何其他突变高倍为μ。直到细胞暴露于μ的药物后驱动的集落形成才会消失。图图在存在抗抑制剂的情况下不依赖贴壁的集落形成被消除。

表达每种转化突变的细胞在浓度不断增加的左和

右的情况下接种。细胞进行血清饥饿并暴露于指定浓度的小时然后用进行配体刺激分钟之后裂解细胞并通过免疫印迹进行探测。这些实验是用其他几种临床抑制剂进行的这些结果记录在补充图中。查看大图下载幻灯片在存在抗抑制剂的情况下不依赖法国企业电子邮件列表锚定的集落形成被消除。表达每种转化突变的细胞在浓度不断增加的左和右的情况下接种。细胞进行血清饥饿并暴露于指定浓度的小时然后用进行配体刺激分钟之后裂解细胞并通过免疫印迹进行探测。这些实验是用其他几种临床抑制剂

的这些结果记录在补充图中为了确定是否抑

制突变型和驱动的集落形成我们评估了信号通路中几种蛋白质的磷酸化。随着浓度的增加磷酸化磷酸化和磷酸化的水平均下哥伦比亚电话号码列表降图这表明由于介导的信号传导减少而导致集落形成丧失。为了评估是否通过特异性抑制激酶发挥作用还使用选择性激酶抑制剂以及帕唑帕尼参考文献和多维替尼参考文献两种对家族成员具有特异性的多激酶抑制剂进行了这些测定。对于所有表达突变的细胞在存在下集落形成被抑制至少而表达激活插入的细胞直到μ才丧

刺激条件下磷酸化在时丢失补充图。与激活的相比多韦替尼还抑制表达突变的细胞中的集落形成但突变之间的一致性较差。突变在和μ多韦替尼之间失去的集落形成。相比之下对于激酶结构域突变不包括集落形成在至之间被抑制其行为与突变相似。表达和的细胞在至之间敏感。同样突变型转化的细胞在暴露于μ药物之前不会失去集落形成补充图左。

突变型表达细胞在处持续磷酸化至μ多韦替

尼突变补充图。帕唑帕尼在至μ药物浓度下同样抑制表达所有和突变的细胞中的集落形成而表达突变的细胞即使在μ药物存在下也形成集落补充图右。生化研究一致表明暴露于μ帕唑帕尼的突变细胞中存在持续的磷酸化而在至μ帕唑帕尼的突变细胞中可检测到芬兰企业电子邮件列表的磷酸化消失补充图。在表达和的突变以及激酶结构域突变的细胞中我们观察到低浓度的赋予了高于对照的生长促进表型但在较高浓度下该表型被消除图左。使用个单位的聚合酶将双链平端化使用苯酚氯仿抽提进行纯化并在没有生物

素标记的核糖核苷酸的情况下进行转录产生未

标记的然后将其用作第二轮的起始材料。在第二个循环中如上所述合成第一和第二链。第二次转录在生物素标记的核糖核苷酸存在的情况下进行产生标记的。如上所述将片段化并添加到杂交混合物中。系统用于探针阵列的杂交染色和成像。制备μ杂交混合物每份包含μ片段化和外源杂交对照并在中国电话号码列表°下与杂交过夜。使用与藻红蛋白连接的链霉亲和素分子探针检测杂交片段。使用基因芯片操作系统版本对进行扫描和成像。对估计的基因表达值进行对数转换。进行双样本检验作为确定样本组之间平均基因水平显着差异的标准。通过确定测试组中未记录的表达值的平均值与对照组的比率来估计组之间表达的倍数变化测试组与对照组我们使用小鼠。

称为非典型乳头状细支气管增生其细支气管上皮的乳头状增生主要位于细支气管末端部位由柱状上皮单形或轻度非典型细胞和中央纤维血管核心组成这在较大的乳头状结构中最常见图和。周龄时未观察到癌。图图显微照片显示对照小鼠中正常肺组织学的代表性实例以及在荷瘤小鼠–中观察到的多个病变。插图以更高的放大倍数显示了每个病变的特殊细胞和结构特征。

啊啊肺泡腺瘤具有乳头状结构的肺泡腺瘤

广泛增生的乳头状结构多发性充盈大支气管气道管腔。入口图片描绘了由中央纤维血管核心组成的乳头内衬细胞学正常细胞。与缺乏纤维组织的入口中的乳头相比入口中描绘的乳头状结构显示出致密的纤维和血管核心。样病变非典型上 德国企业电子邮件列表 皮细胞以鳞片状生长。具有侵袭性和间质反应的腺癌。和年龄匹配周的小鼠和ΔΔ小鼠的全肺切片。放大倍数×和×插图和×和。查看大图下载幻灯片显微照片显示

对照小鼠中正常肺组织学的代表性实例

以及在荷瘤小鼠–中观察到的多个病变。插图以更高的放大倍数显示了每个病变的特殊捷克共和国电话号码列表细胞和结构特征。啊啊。肺泡腺瘤。具有乳头状结构的肺泡腺瘤。。乳头状结构广泛增生多发性填充大支气管气道管腔。入口图片描绘了由中央纤维血管核心组成的乳头内衬细胞学正常细胞。与缺乏纤维组织的入口中的乳头相比入口中描绘的乳头状结构显示出致密的纤维和血管核心。样病变非典型上皮细胞以鳞片状生长。

具有侵袭和间质反应的腺癌。放大倍数×和×插图和×和。失活加速致癌诱导的肺部肿瘤发生。小鼠与小鼠杂交产生ΔΔ小鼠。从这些小鼠获得的肺组织样本中的表现出条件和等位基因的重组补充图泳道。尽管最初很健康但到了两个月大时它们开始表现出体重减轻和呼吸急促。他们的中位生存期为周图。尸检时ΔΔ小鼠的肺比小鼠的肺更大且更重图和。

未观察到胸外转移性疾病。图图ΔΔ小鼠中

肺部肿瘤发生的加速。失活缩短了小鼠的存活时间。具有指定基因型的小鼠的生存曲线。失活导致肺体积增加。从ΔΔ小鼠和对照小鼠获得的代表性肺部照片。失活导致肺重量增加。在指定时间点处死的小鼠的平均右肺重量每组只小鼠。查看 法国企业电子邮件列表 大图下载幻灯片ΔΔ小鼠肺部肿瘤发生加速。失活缩短了小鼠的存活时间。具有指定基因型的小鼠的生存曲线。失活导致肺体积增加。从ΔΔ小鼠和对照小鼠获得的代表性肺部照片。导致的肺重量增加失活。在指定时间点处死的小鼠的平均右肺重

量每组只小鼠。为了检查肺组织学变化在至周龄时

处死ΔΔ小鼠。这些小鼠早在周龄时就发现了病变并被分类为增殖性腺瘤或或直接癌。在两只小鼠中在小支气管和大支气管结构中检测到病变这些病变比和小鼠中的病变位置更近。这些小鼠的支气管和细支气管气道有广泛的乳头增生有多个大乳头和致密的纤维化核心堵塞气道管腔图和。另一种不同类型的上皮病变细支气管肺泡细胞癌样病变其特征是细胞增殖外观呈圆柱形或立方体核轻度异型性细胞质充满粘液物质沿肺丹麦电话号码列表泡间隔生长图。这些肿瘤表达细胞角蛋白数据未显示支持其上皮起源并且是阳性表明存在粘蛋白而染色在来自的肿瘤中不太明显小鼠补充图。它们的外观模仿了人类粘液性肺腺癌的一种亚型的生长模式。

征是两个独立的结节直径分别为毫米和毫米由恶性上皮细胞组成具有高度细胞学异型性和有丝分裂频率增加其中一些非典型具有实性腺泡和乳头状生长模式和侵袭特征图。与小鼠相比ΔΔ小鼠的正常肺被肿瘤更广泛地替代并且病变数量更多图和补充表每个组织学类别。我们得出的结论是与小鼠相比ΔΔ小鼠的肺部病变发展得更早数量

更多并且表现出更严重的组织学变

化。支气管和肺泡肿瘤具有不同的表型。两种携带肿瘤的基因型均在肺泡和支气管室中形成肿瘤。在一些小鼠中支气管肿瘤与肺泡肿瘤相邻这增加了相邻肿瘤在表型上不同的可能性。为了研究这种可能性我们检查了和的表达分别作为 芬兰企业电子邮件列表 支气管和肺泡上皮细胞的标记。事实上肺泡病变内的大多数细胞是而支气管肿瘤是图。这种表达模式在两种荷瘤基因型中都很明显ΔΔ和。我们得出的结论是本研究中的小鼠产生了表型不同的肿瘤表现出支气管或肺泡上皮标记。图图支气管和肺泡肿瘤的表型不同。

小鼠肺组织的免疫荧光染色代表性图像用于检测

合并的绿色和红色。方框区域表示支气管肿瘤和肺泡肿瘤。查看大图下载土耳其电话号码列表幻灯片支气管和肺泡肿瘤的表型不同。小鼠肺组织免疫荧光染色的代表性图像用于检测合并的绿色和红色。方框区域表示支气管肿瘤和肺泡肿瘤。失活会增加瘤内血管分布和炎症。在我们研究的突变肿瘤中检测不到而磷酸化核糖体蛋白高度表达补充图这与不受限制的激活一致。致癌转化的细胞中激活的后果之一是趋化因子表达增加导致瘤内炎症和血管生成进而促进肿瘤细胞增殖–。我们假设缺失增强了这些细胞类型对肿瘤的浸润并通过进行免疫组织化学分析来量化肿瘤内巨噬细胞参考文献内皮细胞因子参考文献和中性粒细胞参考文献补充图来检验这一假设。

学的相关性显示ΔΔ小鼠的病变中中性粒细胞和内皮细胞的浸润高于小鼠的病变补充表表明失活与该特定病变中中性粒细胞和内皮细胞的流入相关。离子。比较内恶性进展不同阶段的病变突变肺显示中性粒细胞和内皮细胞在样病变中比在病变中更常见补充表表明这些细胞类型的浸润随着恶性进展而增加。相反在ΔΔ小鼠中巨噬细胞的浸润随着恶性进展

而急剧减少并且不随病变中的基因型而

变化补充表表明失活对肿瘤微环境的影响是细胞类型特异性的。失活使肺部富含编码生长因子和趋化因子的基因。这些模型的研究结果表明失活加速了——引发肺部恶性进展并增强瘤内炎症和血管分布。基于这些发现我们假设致癌诱导的肺 荷兰企业电子邮件列表 肿瘤发生部分是由宿主对转化的肺泡上皮细胞存在的反应驱动的。这些细胞分泌趋化因子招募宿主炎症细胞成纤维细胞和内皮细胞进而分泌趋化因子和生长因子促进上皮细胞扩张从而加速肿瘤发生。作为识别可能参与该过程的肽的第一步我们检查了整

个肺组织包含肿瘤和周围正常肺的基因表

达认识到关键肽可能源自任何或所有这些细胞类型。我们对周龄时处死的厄瓜多尔电话号码列表两种荷瘤基因型ΔΔ和和两种非荷瘤基因型ΔΔ和的肺组织样本进行转录谱分析。使用特定标准相对于对照组至少增加或减少倍总共个因失活而差异表达的基因突变或两者均被鉴定。然后针对一组预定义的感兴趣表达模式对这个转录本进行监督聚类分析以识别四种基因型中每种基因型的共表达基因簇图。鉴定了四个主要基因簇相对于

报告的最新数据表明成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶是该疾病中最常改变的激酶家族之一。观察到的扩增与之前的报道一致。此外和的突变被报道。尽管这些突变的频率在检查的队列规模中并未达到统计学显着性但一些特征包括复发先前观察到的其他癌症类型和先天性综合征以及突变肿瘤中缺乏其他显性致癌改变表明它们可能正

在导致患有这种疾病的一部分患者发生可靶向事

件。酪氨酸激酶家族的种系突变首次在颅面和骨骼综合征中被描述。在恶性肿瘤中也观察到了与这些种系事件相同的体细胞点突变。家族由四个活性成员组成每个成员均包含一个胞外结构域和一个胞质激酶结构域。中和硫酸乙酰肝素蛋 爱沙尼亚企业电子邮件列表 白聚糖的结合刺激激活随后两个受体配体复合物二聚化导致激酶结构域转磷酸化。这会导致结合伴侣磷酸化以及和通路下游激活。家族由多个成员组成所有成员都保留了不同家族成员和每种受体不同亚型的特异性。此外表达受体亚型和配体的

组织类型也各不相同这进一步增加了系统

的复杂性。失调可导致肿瘤发生如体细胞基因组事件驱动的受体表达改变埃及电话号码列表亚型表达改变和配体特异性改变所示。异常的信号传导与多种癌症类型的发展有关。在其他三个基因型中的表达在突变体样品中高表达的基因簇相对于在其他三个基因型中的表达在突变体样品中表达水平降低的基因簇在突变体和突变体中均高度表达的基因野生型样品相对于其在其他两个基因型中的表达簇以及在突变体和突变体野生型样品中相对于其在其他两个基因型中的

它可能抑制第二种可能影响或信号传导的激酶。当使用另外两种具有抗活性的多激酶抑制剂帕唑帕尼和多韦替尼进行这些实验时也观察到了这种现象补充图但使用更具选择性的激酶抑制剂进行时没有观察到这种现象图正确的。依赖性细胞中和抑制的分析为了测试由突变的驱动的细胞转化是否可

以在第二个系统中被小分子抑制剂消除并

测试这些化合物的相对功效我们生成了表达突变的细胞这些细胞在贴壁依马耳他商业电子邮件列表赖性测定中显示出显着的集落形成。这些细胞系在和肝素存在且不存在的情况下依赖于信号传导。通过免疫印迹测量激酶结构域和的磷酸化有趣的是与表达其他突变的细胞相比表达的细胞显示出两种分子的更大程度的磷酸化尽管表达水平相似图。图图依赖信号传导的细胞对抑制剂敏感。通过用或和肝素交换来分离依赖信号传导的细胞。裂解这些细胞并探测或表达

磷酸和磷酸肌动蛋白用作加载对照在浓度不断增加的

左或右存在下将表达每种突变构建体的细胞接种到孔板中。天后用测量增殖。计算每个突变的值。这些实验是用其他抑制剂进行的这些结保加利亚电话号码列表果记录在补充图中。查看大图下载幻灯片依赖信号传导的细胞对抑制剂敏感。通过用或和肝素交换来分离依赖信号传导的细胞。

磷酸和磷酸​​。肌动蛋白用作加载对照。在浓度不断增加的左或右存在下将表达每种突变构建体的细胞接种到孔板中。天后用测量增殖。计算每个突变的值。这些实验是用其他抑制剂进行的这些结果记录在补充图中。首先将表达和突变转基因的细胞接种到含有浓度不断增加的的培养基中。我们观察到在约的药物治疗下抑制了表达突变的细胞的独立增殖但表达激活插入的细胞或在存在下生长的亲代细胞仅被μ的药物抑制图左。

还计算并绘制了表达每种突变体的细胞的值

图左边。这些测定也在接种到含有的培养基中的细胞上进行类似地表达突变的细胞但不是插入丹麦企业电子邮件列表的细胞或亲本细胞在约抑制浓度的药物下被抑制图右和图右。有趣的是在存在的情况下不敏感的对照似乎在浓度范围为至的药物存在下获得了生长优势图类似于我们在不依赖贴壁的集落形成测定中的观察结果图和补充图。为了进一步评估系统中小分子激酶抑制剂的效力我们组装了文献中描述的一组激酶抑制剂参考文献补充表并测试了

每种抑制剂存在下的抑制反应这些抑制剂中

的每一种都显示出与和相似的趋势与对照相比表达突变的细胞的药物敏感性呈多对数增加补充图。还计算了每种药物存在下每种突变巴西电话号码列表的值补充图。引人注目的是以亚型黄色表达的反复表现出高出至倍的与同工型和激酶结构域中突变的任一同工型相比的浓度补充图。